生物化学实验指导
李峰 李荣 张建平 编
湖南文理学院生命科学系
前 言
生物化学实验是以生物为研究对象，利用生物化学的原理和方法，阐明生物体内化学分子的结构与化学反应的机理，从分子水平探讨生命现象的本质，并为人类服务的一门实验科学，是生物科学、农学、动物科学专业、生命学科相关专业本科生及与湖南省中学生物学教师及科技人员重要的专业基础技术。它是在植物生物学、动物生物学、微生物学等普通生物学实验有比较全面了解及一定基础训练基础上开设的实验技术。旨在培养具有现代生物学知识，掌握现代生物化学技术的创新人才培养具有现代生物学知识前沿、掌握现代生物学基本技术，具有综合设计、创新实验能力的创新人才。
《生物化学实验指导》是熊大胜教授主持的“生物学基础实验‘531’课程体系研究”的实验教材之一。生物化学实验模块按生物化学及生化大实验的实验功能构建，承担《生物化学实验》及《生物化学与分子生物学大实验》。生物化学实验模块以提高学生应用生物化学原理和方法，解决生产实践中的实际问题为目标，改革以往生物化学实验教学大纲，从加强基础的观点出发，侧重于学生基本技能，综合能力，创新能力三个层次的培养，同时也注意增加一些新近发展起来的重要的生物化学研究方法和技术。
生物化学实验模块共包括15个实验。实验注重加强学生基本技能的培养，使学生掌握蛋白质和核酸的基本结构及组分鉴定方法；掌握蛋白质性质的综合测定，了解蛋白质沉淀和变性等重要概念；掌握最常用的蛋白质制备、分离和纯化过程和方法；通过淀粉酶的提取，活性测定以及淀粉酶动力学分析实验，加深对酶的特性认识；进一步熟悉掌握微量滴定法的基本操作技术；注重培养学生综合能力，通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作，掌握氨基酸含量的测定方法；掌握核酸的提取过程以及核酸含量和纯度的测定技术；熟悉掌握电泳技术的基本原理和操作技术；血糖的定量测定和脂肪酸的β－氧化实验，掌握有关物质代谢中生理生化指标的测定方法；在生化大实验中开设了《总RNA的提取及鉴定》和《半定量RT-PCR检测基因的表达差异》两个综合性大实验；本实验模块还开设了为期6周的选修开放项目《基因的克隆、鉴定及生物信息学分析》（创新实验），使学生更好的将基础知识与专业技术衔接。通过该实验课的基本训练，使学生掌握常见生物化学及分子生物学技术的原理和方法，提高学生独立思考、观察、分析问题和解决问题的能力，同时培养学生的创新意识、科学素养和科研能力。通过实验，巩固和加深生物化学课程的基础理论知识，为今后的科学研究打下坚实的生物化学基础。
编者于湖南文理学院
20##年12月
目 录
第一篇 常用生物化学实验技术及原理
第一章 透析 …………………………………………………（1）
一、膜 ……………………………………………………………………（1）
二、溶剂 ……………………………………………………………………（1）
三、物理条件 ………………………………………………………………（2）
四、Donnan 平衡 …………………………………………………………（2）
第二章 层析法 …………………………………………………（3）
一、柱层析法的一般技术……………………………………………………（3）
二、几种常见的层析法 ……………………………………………………（5）
第三章 电泳技术 ……………………………………………（18）
一、电泳技术的基本原理……………………………………………………（19）
二、纸电泳 …………………………………………………………………（21）
三、醋酸纤维薄膜电泳………………………………………………………（22）
四、琼脂糖凝胶电泳 ………………………………………………………（22）
五、聚丙烯酰胺凝胶电泳 …………………………………………………（23）
第二篇 学 生 实 验
实验一 蛋白质的性质实验 …………………………………（30）
实验二 牛乳中蛋白质的提取与鉴定…………………………（35）
实验三 氨基酸的分离鉴定??纸层析法……………………（37）
实验四 酶的特性………………………………………………（39）
实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定……………………（46）
实验六 紫外分光光度法测定核酸的含量……………………（49）
实验七 维生素C的定量测定…………………………………（51）
实验八 血糖的定量测定??GOD-PAP法………………………（54）
实验九 脂肪酸的β－氧化……………………………………（57）
实验十 DNA的琼脂糖凝胶电泳………………………………（60）
实验十一 蛋白质的透析………………………………………（62）
实验十二 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳??血清蛋白的分离 ……（64）
实验十三 总RNA的提取及鉴定………………………………（69）
实验十四 半定量RT-PCR检测基因的表达差异………………（76）
实验十五 基因的克隆、鉴定及生物信息学分析………………（82）
第一篇 常用生物化学实验技术及原理
第一章 透析
透析是利用小分子能通过,而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。通常的做法是将小分子和大分子的混合物放进用半透膜制成的透析袋里并沉没在大量的水中。袋内的小分子就不断通过膜进入外部溶剂中待达到平衡为止。如果对流水透析或不断更换透析袋的溶剂可以做到袋内的混合物几乎不含小分子。透析的速度受一些因素的影响。下面就粗略地讨论这些因素。
一、膜
1、材料 火棉胶是最常用的透析袋材料。各种规格的火棉胶袋已做成商品出售。也可用玻璃纸代替火棉胶。
2、制备 先将一适当大小和长度的透析管放在碱性EDTA溶液中沸腾30分钟以避免待透析的分子损失活性。然后，用蒸馏水洗涤透析管。结扎管的一端并将所研究的材料充满透析管（袋），然后结扎顶部。透析最好在新制备的管中进行，因为湿的透析袋非常容易受微生物感染。如果必须保存透析袋，则应有溶液中加入痕量的苯甲酸。
3、通透性 透析袋的通透性因袋的大小和预处理的方法不同而异。但透析过夜时，半透膜大体可以允许相对分子质量（Mr）30000以下的化合物通过。实际上没有严格的界限，透析时间延长时稍大的分子也透过膜。有一系列的商品材料有更高的透析速度和更精细的通透范围可做精细分离之用。
二、溶剂
1、水溶液 一般说，透析的速度在蒸馏水中最大，虽然通常需要特定的pH和离子强度的水溶液来稳定所研究的分子。
2、大分子溶液 透析时水将进入透析袋，因此应该将透析袋装满以避免透析的材料过于稀释。如果用一种不活泼的高分子化合物如聚乙烯醇6000代替通常使用的水溶液作为溶剂，则透析时水就会由透析袋中渗出，用这种方法透析过夜，可将200mL溶液浓缩至几mL。
三、物理条件
1、温度 透析速度也受温度的影响，温度越高透析速度越快。提高温度时，溶剂的粘度降低而扩散速度增加。此外，许多大分子对温度很敏感，因此蛋白质等的透析通常在低温条件下进行。
2、压力 大分子和小分子的分离也受通过膜时的压力梯度影响。可将透析袋放在真空中（而不放在溶液中），并敞开透析袋的一端，此时水和小分子会渗出透析袋形成超滤液，而留在透析袋中的大分子被浓缩。这个过程称为超滤。
四、董南（Donnan）膜平衡
由于大分子电解质的存在，而使一般电解质不均等分配在半透膜两侧的平均状态，称为膜的平衡。
蛋白质溶液的渗透压与溶液的pH有关系。有酸性pH下，蛋白质以阳离子存在，带有正电荷；而在碱性pH下，以阴离子存在，带有负电荷。当蛋白质盐溶液透析时，带电的蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中对立的阴离子或阳离子就要通过半透膜以平衡电荷，这就导致离子的膜两边不均等的分布，同时关系到pH的变化。这种现象有就称为董南效应，又称分布，同时产生pH的变化。这种现象就称为董南效应，又称董南平衡。如带负电荷的蛋白质盐溶液对水透析时，蛋白质不能透过透析袋，而它的反离子可以通过，结果造成环境介质中阳离子过多。为了保持中性，水就分解出氢离子移进透析袋内，蛋白质部分的pH因此下降而水部分的pH上升。反之，如蛋白质带正电荷，则pH的变化相反。董南效应可以导致蛋白质沉淀或变性，因而是不可取的。为减少董南效应，透析通常对具有适当浓度的盐溶液进行。
第二章 层析法
层析法也称色谱法，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，可以根据所用两个相的状态和操作方式不同进行分类如表3-1。
表2-1层析法的一般分类
此外，还有凝胶层析、亲和层析和高压液相层析等方法。在讨论几种常用的层析法之前，先介绍一下柱层析法的一般技术。
一、柱层析法的一般技术
1、柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨力好，但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。
2、层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到需的电离形式。
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低
3、装柱 层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶液彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。
4、加样 上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
5、洗脱 下一步是用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。
在取代扩展法中，溶剂与层析材料的相互作用比柱上的物质与层析材料的相互作用要强，于是与柱结合的分子被取代。每一个柱能结合多少物质都有一个限度（即总柱容量）。在取代扩展的情况下，当样品上柱量差不多达到总柱容量的50%时，一般尚能完全完分离。但是为了得到更好的分辨力，洗脱法更为可取。
洗脱法是最常用的方法。使用洗脱法，上柱量不超过总柱容量的10%，溶剂与柱相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。另外，还有一个可行的方法是逐渐改充溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是能够减少拖尾现象。
6、部分收集及分析 柱的流出液可以用人工的方法收收集到一系列试管中或使用部人收集器。这种装置能使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。第一部分的蛋白质或核酸的含酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280nm或260nm的光吸收来进行连续监测。
二、几种常用的层析法
（一）吸附层析
这是首次由Tswett用来分离色素的层析方法。吸附剂的经典含义可能说成是一种表面具有吸咐分子的特性的固体（特别是当它是多孔的和分得很细的时候）。如氧化铝、硅胶、活性炭等固体物质都具有吸附性能，可以将一些物质自溶液中吸附到它的表面。它和离子交换换树脂不同，吸附剂表面和分子的吸引力，理论上不含有静电力。吸附可以是非常特异的，以致于可以从一个混合物中选择性地吸附一种物质。用这种方法所以能进行各种成分的分离是由于它们被吸附剂所吸附的程度以及它们在分离用的溶剂中的溶解度有差异。当然这些特点是由各成分的分子结构所决定的。
例如，在柱吸附层析中，混合物的分离是在装有适当吸附剂的玻璃柱中进行的。混合物加到柱上，然后用一个适当的溶剂(或是混合溶剂)通过这个柱。混合物就随着溶剂的流动而逐渐分开。最初溶剂刚倒在吸附柱上时，混合物被吸附剂逐渐分开。最初溶剂刚倒在吸附柱上时，混合物全被吸附剂吸附在柱的上层，当继续加入溶剂时，柱中就会连续不断地发生混合物中各物质的溶解，吸附，再溶解，再吸附的反复交替过程。如被吸附的某物质被溶剂解出来（解吸作用）后就随着溶剂向下面流动，当遇到新的吸附颗粒时，又从溶剂中吸附出来，后面继续流下来的新溶液又再把它溶解出来并被带着往下移动，又再被吸附。就这样，经过一段时间之后，混合物中各物质都会从柱顶向下移动一段距离，但是由于各物质被吸附剂吸附的程度以及它们被溶剂溶解的能力不同而向下移动的距离不同因而彼此分离。吸附性弱的，就比较容易被溶剂溶出，又因为它再被吸附的力量比较弱，所以在柱中移动的距离就大些。经过适当的时间后，混合物中各物质就可以完全分开。
现在一般最常用的方法是在各组分离以后，让柱继续展开，用溶剂把被吸附的物质由吸附柱上冲洗出来，部分地收集从柱上流出的洗脱液，随后再进行分析。
对任何一种特殊的吸附剂和溶剂洗脱系统的选择由所要完成的分离来决定。在选择吸附剂时必须小心，因为有时一些吸附剂在分离时可引起某些化合物的降解。
吸附层析的操作方式在柱型和薄层两种。具体操作技术请见本章“一、柱层析法的一般技术”和“（四）薄层层析”两部分。
（二）离子交换层析
离子交换层析利用含有能与周围介质进行离子交换的不稳定离子的不溶性基质来分离分离物质。
1、离子交换基质 Adams和Holnes有1935年通过酚、甲醛和磺酸缩聚成不溶性树脂，制成了第一个人工合成的离子交换材料。从此以后，人工合成的离子交换树脂日见增多（多数是从芳香族化合物合成的），由苯乙烯及交联剂二乙烯苯聚合得到的物质是一种常用的树脂基质。
通过适当的反应再将可电离基团引入到芳香环上，二乙烯苯和苯乙烯的相对含量决定了聚苯乙烯链之间的交联度。交联度是指这种树脂骨架中含有二乙烯苯的重量百分率。国产树脂的交联度一般为4%~14%。树脂的交联度小时，则水溶性强，加水后树脂的膨胀性大，网状结构的网眼大，交换反应快，交换选择性低。相反，树脂的交联度大时，则水溶性弱，加水后树脂的膨胀性小，网眼小，交换慢，具有一定的选择性。
离子交换树脂适合分离小分子物质，如氨基酸，但对于大分子，如蛋白质是不适合的，因为大分子不能进入树脂紧密交联结构的内部。因此大分子可以用取代的纤维素和葡聚糖来分离，这些物质的分子是纤维状的，它们的大部分功能基团在表面。
2、可电离基团 按照离子交换树脂对阴离子或阳离子的亲合特性可以分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。例如，阳离子交换树脂交换周围介质的阳离子，也就是说，决定树脂究竟是阴离子的还是阳离子树脂的可交换离子所带的电荷，而不是基质上所带的电荷。
这两种类型又可进一步分成含有强电离基团的，如强酸型和强碱型；及弱电离基团的，如弱酸型和弱碱型。强离子交换树脂是完全电离的，并以带电形式存在（在极端pH值时例外）。弱离子交换树脂所含基团的电离程度依pH一个狭窄的pH范围有最大交换容量方能使用。一般含羟基的树脂在pH6左右有最大容量，而带有氨基的那些树脂在pH低于6时才有效。
离子交换纤维素含有取代了纤维素一OH的弱电离基团，这些基团的密度比较低，因为取代太多时就会使纤维素变得可溶。
对于分离结合较弱的大分子时，用弱电离部位密度较低的交换剂适合，而且在温和条件下容易解析。
3、离子交换平衡 典型的离子交换反应过程说明，在这里用含有氨基的阴离子交换树脂分离两个负电性离子。树脂可电离基团的浓度几乎可以达到6~10mol/L，因此有很高的交换容量。
虽然一般以为离子交换树脂的作用仅仅是通过离子交换过程来分离物质，但实际上也可能存在吸附作用和分子筛作用。
4、结合离子的洗脱 结合离子可以通过改变缓冲的pH来洗脱。例如，当pH靠近一种蛋白质分子的等电点时，这种蛋白质分子的净电荷就减少，与树脂的结合就减弱而被洗脱，别的带电的蛋白质仍然结合在柱上，这样就达到了分离的目的。另外，溶剂中的离子要与结合离子对离子交换剂的可电离基团发生竞争，溶剂中的离子浓度高时，就会取代结合离子，所以增加离子强度也可将结合离子洗脱。
pH或离子强度可以通过更换洗脱缓冲液陡然地改变，可用前面介绍的梯度方法逐渐地改变。
离子与树脂的结合是一种动态平衡，其结合程度取决于树脂的性质、温度、离子强度和溶剂成分。同时还与树脂的电离度和被分离的物质有关。高价离子最容易结合而不易洗脱，所以在用一种高价离子取代结合离子时应使用稀溶液，而如果要导入一种低价离子时则需用浓溶液。
5、离子交换材料的准备 树脂和取代多糖（取代纤维素、取代葡聚糖）首先要在蒸馏水中吸胀，并去掉过细的颗粒。商品树脂，特别是阳离子交换剂会含有铁或其他重金属，可以用2~4mol/L的盐酸洗涤去除。
通过用适当的溶液洗涤可获得所需要的离子形式的离子交换材料。例如，氢型的阳离子交换树脂是先用盐酸洗涤，然后用水洗涤直至流出液呈中性为止。同样制备钠型是用氯化钠或氢氧化钠溶液洗涤树脂，再用水洗涤至中性。
装柱前的最后一步是用洗脱缓冲液平衡树脂，显然缓冲离子必须是不与树脂结合的。
6、离子交换层析的操作技术 详见本书第三篇演示实验二。
（三）分配层析
常用吸附层析分离法易溶于有机溶剂而难于水的混合物。可电离的水溶性混合物最适宜用离子交换层析法分离。分配层析法界于二者之间，在水和有机溶剂中都可溶的混合物用分配层析法易分离。
当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是所谓的分配系数（a）。
分配层析法实际上是一种连续抽提法。在这里，一种溶剂通常是被结合在固定的惰性支持物（柱或膜）上的水，另外一相由流动的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相，如果某一混合物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。
1、纸层分析的理论 Consden，Gordom和Martin首先用滤纸作支持物并以茚三酮为灵敏显色剂，建立了微量而简便的分离蛋白质水解液中氨基酸的方法。不久又发现除了氨基酸外，糖、核苷酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离，因而纸层析成为生物化学工作中一种常用的分离分析方法。
滤纸是理想的支持介质。在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶剂就在水相和有机相之间进行分配，且部分溶质离开原点随有机相移动而进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。等纸干后，可用适当的显色方法使混合物中各组分在纸上的位置显示出来，物质移动的距离与溶剂移动距离之比就是Rf值。某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf值基本上是常数。
如果固定相不完全是惰性的，那么既发生分配，又有吸附作用和可能的离子交换，Rf和a的关系等式就会有例外。
2、样品的制备和点样 在研究生物材料时，做层析以前样品要脱盐（用离子交换或电渗析），过量的盐会使层析谱扩散和Rf值改变，同时还会影响辨认分离组分的化学反应。在层析前还可用超滤或葡聚糖来除掉蛋白质。然后用微量点样管将样品溶液（2~20µL）点于纸上，点的直径不超过0.3~0.5cm，如样品太稀需重复点几次时，每次点之前均应吹干，点间距离约2~3cm。
3、纸的选择 滤纸的质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。一般分析工作可采用新华1号滤纸（或Whatman1号），若有较多的样品需要在纸上分离提纯时则适合采用新华3号（或whatman3号）厚纸，可是其分辨力比1号滤纸差。
溶剂顺着纸的纹道扩展速度快，否则速度慢。
必要时，使用前可将滤纸用缓冲液浸泡或经乙酰化作用进行化学修饰。
4、溶剂的选择 溶剂的选择与纸的选择一样，主要是根据经验，同时也取决于所要分析的物质。如果在溶剂A中样品物质移动离溶剂A的前沿近，那就是溶解度太大；如果在溶剂B中它们靠近原点周围，那就是溶解度不够大，因而合适的溶剂应该是A和B的适当的混合物，以使样品各组分的Rf值能在整个纸的长度上散布开，在某些分离中pH是一个重要因素，很多溶剂含有乙酸或氨以形成一个酸性或碱性的环境。
5、展层 虽然展层的方式可以不同，但其共同点都是将点好样品的滤纸固定，使其一边与溶剂槽接触，让溶剂扩展，整个装置扣在密闭的容器内，槽壁衬垫浸透溶剂的滤纸以保持恒定的蒸气压并且放在恒温室里，温度的波动全使溶剂走得不均匀，并改变Rf值。
展层方式有上行、下行和环行。
上行层析是比较常用的方法，它的优点是可以在两个方向上进行（即双向层析）。混合物先在第一种溶剂中被分离（溶剂应是挥发性的），干燥后将纸转900，再在第二种溶剂中进行层析。显色或用其他方法定位后得到的层析图谱与在相同条件下已知物的层析图谱比较就能鉴定混合物的各组分。
下行层析适用于一些Rf值接近的混合物。
因为溶剂滴离纸的底部，这就能使各组分较充分地分离。当然在这种情况下不能测定Rf值，而只能与标准参考物，如葡萄糖相比较。
6、显色 大部分化合物是无色的，可以用特殊的显色剂使其显色，配制显色剂时最好使用与水不混溶且挥发性较大的溶剂。显色剂可用喷雾器喷雾或迅速将纸在显色剂中浸渍。
如果被分离物质本身具有紫外吸收性质，可在紫外线照射下与纸的荧光背景对照显出暗的斑点。另外，有些化合物在紫外线下发出特殊的荧光。
（四）薄层层析
и3MaÑJIOB和IIIpaÑбep在1938年叙述了植物萃取物在氧化铝薄层上的分离，但是直到1956年以后薄层层析才逐渐引起各方面的注意和重视。
薄层层析法是将支持物在玻璃板上均匀地铺成薄层，把待分析的混合物加到薄层上，然后选择合适的溶剂进行展开，而达到分离鉴定的目的。薄层层析兼有柱层析和纸层析的优点。它操作方便，设备简单，展开时间短，一般只需几分钟到几十分钟。它灵敏度高，适用于微量样品的分析（小到0.01mg），但是加大薄层的厚度则又能分离较多（大到500mg）的样品。薄层层析还有一个优点是除了可用一般显色剂外，对某些薄层材料还可用腐蚀性显色剂，另外，还可以在支持物中加荧光染料以有助于点的鉴别。
薄层层析法分离物质的原理依所用不同支持物的性质而不同，可以是吸附层析、离子交换层析、分配层析或是凝胶过滤。
1、薄层的制作 在玻璃板上涂铺一层薄层，最简单的方法是在一根玻棒的两端绕几圈胶布，用玻棒压在玻板上，把支持物向一个方向推动，即成薄层。
有时用上述方法制得薄层不太均匀，可能用有机玻璃自制一个涂铺器即能取得满意的结果。
薄层厚度小于200um时将影响Rf值，一般情况下厚度为250um比较合适。
可做薄层材料的物质很多，如硅胶、氧化铝、纤维素粉、DEAE纤维素、葡聚糖等，具体选择哪一种依所研究的问题而定。硅胶对大多数的物质分离都是适宜的。
有时在硅胶中加入煅石膏作为粘合剂，这时一旦与水调合就需快速操作。
2、展开 薄层层析的加样与纸层析基本相同。薄层的展开需在密闭的器皿中进行，溶剂必须达到饱和，可以在器皿内部贴上浸湿了溶剂的滤纸条。薄层层析的展开方式与纸层析一样，可以是上行、下行、单向或双向。
3、定位 和纸层析一样，可用适当的显色剂喷雾或根据组分的紫外线吸收或荧光来定位。在有放射性物质时用扫描来定位。
（五）凝胶层析
1、凝胶层析也称凝胶过滤法，是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。
用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。现以利用交联葡聚糖分离物质和测定相对分子质量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。
交联葡聚糖（商品名Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形式的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小。
把经过充分溶胀凝胶装入层析柱中，在加入样品以后，由于交联葡聚糖的三维空间网状结构，小分子能够进入凝胶，较大的分子则被排阻在交联网状物之外，因此各组分在层析床中移动的速度因分子的大小而不同。相对分子质量（Mr）大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析床。相对分子质量小的物质可以透入凝胶颗粒，流程长，移动速度慢，比相对分子质量大的物质迟流出层析柱。经过分部收集流出液，相对分子质量（Mr）不同的物质便互相分离。SpladexG-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-75到G-200可用于分离相对分子质量大于10000的蛋白质。
交联葡聚糖分子含有大量的羟基，极性很强，易吸水，所以使用前必须用水充分溶胀。1g干重凝胶充分溶胀时所需的水量（mL）称为凝胶的得水值（Wr）。因为得水值不易测定，故常用溶胀度即床体积来表示凝胶的得水性，其定义是每克干重凝胶颗粒在水中充分溶胀后所具有的凝胶总体积。
2、凝胶柱的总体积（总床体积）Vt是干胶体积Vg，在凝胶颗粒内部的水的体积Vi及凝胶颗粒外部的水的体积Vo之和。
Vt也可从柱的直径及高度计算。
Vo也称外水体积。常常用洗脱一个已知完全被排阻的物质（如蓝葡聚糖2000）的方法来测定，此时其洗脱体积就等于Vo。
Vi称为内部体积或内水体积，可以从凝胶干重（mg）和得水值Wr计算：
Vi = mg. Wr
Vi也可以从洗脱一个小于凝胶工作范围下限的小分子化合物，如铬酸钾来测定，其洗脱体积等于Vi+Vo。
某一物质的洗脱体积Ve为：Ve=Vo + KdVi
Kd为溶质在流动相和固定相之间的分配比例（分配系数），每一溶质都有特定的Kd值，它与层析柱的几何形状无关。
如果分子完全被排阻，则Kd=0，Ve=Vo。如果分子可以完全进入凝胶，那么Kd=1，Ve=Vo+Vi。在通常的工作范围内Kd是一个常数（0〈Kd〈1），有时Kd可能大于，则说明发生了凝胶对溶质的吸附。
溶质的洗脱特征的有关参数（Ve/Vo，Ve/Vt，Kd，Kav）都与溶质相对分子质量（Mr）对数成线性关系，先洗脱几个已知相对分子质量（Mr）的球蛋白，用Ve/Vo对logMr对作图，然后在同样条件下洗脱未知样品，从其Ve/Vo值，在图上即可找出相对应的logMr，从而进一步算出其相对分子质量（Mr）。
不同规格的凝胶都有一定的工作范围。一般说，在工作范围之内所得的曲线是线性的，超出工作范围曲线就不成线性。
（六）亲和层析
亲和层析法是分离蛋白质酶等生物大分子的一种极为有效的方法。它在蛋白质分离技术中占有特殊的地位。前面讨论的各种分离方法是根据混合物中蛋白质之间的物理性质和化学性质(如蛋白质的溶解度、电荷、分子大小或疏水作用等)的差别来纯化的。这些方法的主要缺点是具有相似性质的蛋白质，由于性质差别微小而难于分离，而亲和层析是根据某种蛋白蛋对于某种配体的生物专一性。因此，如果能利用这种不同的生物专一性作为分离的基础，就会产生一种有效的纯化蛋白质的方法。早在1910年，就有人发现淀粉能吸附淀粉水解酶，在1951年，有人以“免疫吸附剂”的形式来分离抗体；1967年，Werle等人开始用胰蛋白酶的不溶酶提纯胰蛋白酶抑制剂，等等。经过几十年的研究，逐渐发展成一种新型的分离技术??亲和层析。细胞内任何一种蛋白质都有专一作用的对象。因此，从原则上讲，所有的蛋白质都能通过亲和层析来分离和纯化。与蛋白质发生亲和作用的基团称为配体（ligand）。配体是指能被生物大分子所识别并与之结合的原子、原子基团和分子。例如，酶的作用底物、辅酶、调节效应物、激素的受体、抗原与抗体互为配体。
1、亲和层析的基本原理 蛋白质与配体之间有一种特殊的亲和力，在一定的条件下，它们都紧密结合成复合物，如果将复合物的某一方固定在不溶性载体上，就可以从溶液中专一性地分离和提纯另一方。与其他方法相比，亲和层析能产生绝对的纯化作用，因此，可达到较高的纯度。采用一般的方法是提纯酶、抑制剂等生物制剂，操作十分复杂，而采用亲和层析，只需一步就能提纯百倍，甚至千倍，从而得到纯的产品，产率可达到75%~95%。
2、亲和层析的基本方法 先将提纯的某种蛋白质的配体通过适当的化学反应，共价的连接在载体颗粒表面的功能团上。这种载体材料在其他性能方面，允许蛋白质自由通过，当含有待提纯的蛋白质则与其特异的配体结合，因而被吸附在配体的载体的颗粒表面，而其他的蛋白质因对这个配体不具有特异性的结合位点，将通过柱子而流出。被特异地结合在柱子上的蛋白质，可用自由配体的溶液洗脱下来，或通过改变溶液的pH、离子强度，或采用一些弱的变性试剂减弱其结合，或采用某种更强的结合物质与其竞争，使其从柱中分离出来，达到纯化的目的。
3、固相载体介质 一般用作凝胶过滤的介质，大都适用于亲和层析的介质。它们具有稳定的物理和化学性质，具有均匀、多孔的网状结构，允许大分子物质自由通过，流动性好，非特异性吸附少。这些固相载体首先要用化学方法进行活化，使其具备与特定的配体相结合的化学活性基团。最常用的活化方法是用溴化氰（CNBr）活化琼脂糖，目前已有商品出售。
载体中的邻位羟基和溴化氰反应形成亚氨碳酸基因。此基因通常可以和含氨基或羟基的配体反应，使配体结合在固相载体上。用溴化氰活化直接把配体结合在载体上，能使配体和载体偶联紧密，但是在生物大分子特异结合时，由于空间位阻的效应，会影响大分子结合的效率。改进的方法是在载体上连接一个臂（一般含6个碳原子），臂的未端为一活性基团，如氨基、羧基、活化的酯基等，靠这些活化的基团和配体结合在一起。如CH-Sepharose 4B带有一个6碳长的臂及活性的末端羧基；环氧活化的Sepharose6B，臂上带有一个活化的酯基；AH-Sepharose4B，其臂末端带一氨基；CDI-agarose含有N-氨基甲酸烷基酯。亲和层析的载体多为凝胶，可分成两类：一类是大孔型的凝胶，如琼脂糖凝胶其网状结构的孔径较大，容许大分子自由进出凝胶。另一类为微孔型的凝胶，如交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺基，它们是小孔径的网状结构的凝胶，使分子被排阻在凝胶颗粒之外。琼脂糖凝胶最为常见但缺点是当用变性剂溶液洗脱时易于收缩。今年来出现的，由有机亲水聚合物组成的凝胶，如乙烯聚合物，可抗压、抗酶降解，化学稳定性好，适于中等压力下进行大规模分离提纯。聚丙烯酰胺含有大量的羰酰胺基，可以作为支持物载体，其缺点是孔径太小。表面修饰的硅胶也可以作为亲和层析的介质，而且已应用于高效液相色谱中，这就是高效液相亲和层，它正成为生物工程的一种新工具。
4、配体的选择 配体是亲和层析中最重要的成分。首先，配体必须和被分离的大分子物质能形成适当亲和力的、特异的和可逆的结合。亲和力过低，大分子物质不能和配体有效结合，但过高的亲和力，需要在较强的条件下才能解析下来，而且有可能使某些被分离的大分子物质变性。所以一般要求配合和大分子物质的解离常数为5*0.001~5*0.00000001mol/L。
选择好的配体有3个原则。一是能和欲分离的生物大分子专一性结合，而且亲和力越大越好；二是结合后又能解离，而且无损于生物大分子的生物活性；三是配体上必须含有适当的化学基团，通过这些基团可以用化学方法把配体偶联到载体介质上去，而且这种偶联不损害配体与生物大分子的专一性结合。用于亲和层析的配体大体分为3类：一是对特定蛋白质具有亲和力的小分子配体，如酶的底物（或底物类似物）、调节配体、效应物、酶的辅助因子等；二是对特定蛋白质有亲和力的大分子，如抗体、伴刀豆球蛋白A、蛋白质类抑制剂、维生素或激素的结合蛋白或受体等；三是共价亲和层析中的配体，它含有能与目的蛋白质共价可逆作用部分。
小分子配体与目的蛋白质的结合专一性往往较差。如用固定化NAD纯化脱氢酶时，很多脱氢酶和其他蛋白质都能以类似的亲和力结合NAD，在缓冲液中加入共配体（coligand）和寻找最佳实验条件可增强目的蛋白质对配体的亲和力。
大分子配体有3类：一类是凝集类蛋白质，能结合蛋白质上的糖，可用于纯化糖蛋白，如伴刀豆球蛋白A、抗生物素蛋白能共价结合许多生物素的酶。蛋白质A能结合IgG分子的Fc部分，且亲和力很强；二类是抗体，使用抗体作配体的亲和层析称为免疫亲和层析；三类是对某种蛋白质有很强亲和力的蛋白质，如a-乳清蛋白，它在糖配体（N-乙酰葡萄糖胺）存在下，能与半乳糖转移酶发生强烈的亲和作用。
第三章 电泳技术
带电质点在电场子中移动的现象称为电泳。电泳现象早在19世纪初期就被人们发现了，并用于胶体化学中，但是电泳技术的广泛应用则在20世纪40年代左右。近年来各种类型的电泳技术发展十分迅速。例如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、琼脂糖凝胶电电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、线丝电泳等。在电泳形式上更是丰富多样，有在溶液中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，也有做成平板的或柱状的。由于与光学系统和自动分部收集器相结合，又组成了等电聚焦仪，等速电泳仪等等，大大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。
各种类型的电泳技术概括如下表3-1：
表3-1电泳技术的种类
一、电泳技术基本原理
任何一种物质的质点，由于基本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。倒如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基因，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中分子向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。
不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度的定义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。
泳动度首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响，如溶液的粘度等。影响泳动速度的主要外界因素还有下列几种：
（一）电场强度（电势梯度）
电场强度是指cm的电压降，它对泳动速度起着十分重要的作用。例如，纸上电泳的支持物滤纸两端相距20cm，如电压降为200V，则电场强度为200V/20cm=10V/cm。电场强度越高，带电质点移动速度越快，根据电场强度的大小，可将电泳分为常压（100~500V）电泳和高压（500~10000V）电泳。常压电泳的电场强度一般为2~10V/cm，电泳分离时间较长，有时需要几小时至几天；高压电泳的电场强度为20~200V/cm，电泳分离时间较短，有时仅需几分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，而高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质。在生产中有时需要进行快速的中间分析，如果没有高压电泳设备，可以把常压电泳小型化，缩短滤纸两端距离，也可达到高压快速的目的。如将原来两端相距20cm的滤纸改为5cm，外加电压仍为200v，电场强度则变为40v/cm，这样就加快了电泳速度。
（二）溶液的pH值
溶液的pH值决定带电质点解离的程度，也决定物质质点所带净电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值距等电点越远，质点所带净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。因此，当分离某一蛋白质混合物时,应选择一个合适的pH值，使各种蛋白质所带净电荷的量差异较大，以利于分离。为了使电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液。
（三）溶液的离子强度
离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强越低，质点泳动的速度越快。一般最适合的离子强度在0.02~0.2之间.
在稀溶液中，离子强度的计算方法，是将每一离子浓度乘以其价数的平方，再将所有乘积相加，以2除和。计算公式如下：
离子强度（I）=0.5ΣCZZ
式中：C为离子的摩尔浓度（mol/L）；
Z为离子的价数。
（四）电渗现象
液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。若质点原来向负极移动，则其表面速度比电泳速度快。若质点原来向正极移动，则其表面速度比电泳速度慢。因此，在电泳时应尽量避免使用具有高电渗作用的支持物。
二、纸电泳
纸电泳是用滤纸作为支持物的电泳技术。它包括电泳槽和电泳仪两大部分。电泳槽是进行电泳的装置，其中包括电极、缓冲液槽，电泳介质的支架和不一个透明的罩。常见的电泳槽有水平式和悬驾式等。电泳仪是提供直流电源的装置，它能控制电压和电流的输出。纸电泳可分为低压电泳和高压电泳两类。低压电泳仪的电压一般为100~500V，电流为0~150mA。高压电泳仪的电压主为500~10000V，电流为50~400mA。电泳仪既能输出稳定的电压，又能输出稳定的电流。
纸电泳的设备简单，应用广泛，是最早使用的一种电泳技术。在早期的生物化学研究中，曾发挥重要作用。由于纸电泳时间长，分辨率较差，近年来逐渐为其他快速、简便、分辨率高的电泳技术所代替。
三、醋酸纤维薄膜电泳
采用醋酸纤维薄膜作业支持物的电泳方法，称为醋酸纤维薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯信、氯乙烯、乙酸、乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维薄膜。现有国产醋酸纤维薄膜成品出售。醋酸纤维薄膜具有泡沫状的结构，厚度约为120µm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。
醋酸纤维膜电泳是近年来推广的一种新技术。目前已广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血清蛋白、血红蛋白，球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白，类固醇、同工酶等的分离和鉴定，这种方法具有简单、快速、样品量少、区带清晰、灵敏度高、便于照相和保存等特点。它的分辨力虽然比不上淀粉和聚丙烯酰胺凝胶电泳，但是比纸电泳要强得多，所以现在趋向用醋酸纤维薄膜电泳代替纸电泳。
四、琼脂凝胶电泳
在凝胶电泳中，琼脂凝胶电泳是最早得到广泛应用的。因为它具有下列优点：①在琼脂凝胶中含有琼脂1%~1.5%，其余都是水，在这种凝胶中电泳，近似自由界面电泳，可是样品扩散又比自由界面电泳小；②琼脂凝胶电泳支持物均匀，电泳区带整齐，分辨率高，重复性好；③液相与固相界面无明显界限，电泳速度快；④琼脂凝胶透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪测定；⑤区带容易染色，样品容易洗脱，利于制备；⑥干膜可以长期保存。
除以上的优点外，琼脂凝胶电泳也有它的不足之处，因为琼脂是一种强酸性物质，能造成严重的电渗现象，影响电泳的速度，而且琼脂所含可溶性杂质难于除去。
琼脂凝胶电泳肺痨板式和柱式两种，一般采用平板式。其实验步骤如下：
1、配置缓冲溶液 琼脂凝胶电泳常用缓冲溶液的pH值多在6~9之间，离子强度为0.02~0.05。离子强度过高时，由于大量电流通过琼脂板将产生热量，使板中水分大量蒸发而析出盐的结晶，甚至使用琼脂板断裂，电流中断。常用的缓冲溶液，有硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液。
2、制板 制板常用的琼脂浓度为1%~1.5%。因为用这个浓度制成的凝胶富有弹性、坚固不脆。将一定两的琼脂用水浴加热熔化，趁热与等体积预热至60℃的缓冲液混合，使其浓度为1%~1.5%，继续加热至表面无气泡，迅速将凝胶倒在水平玻璃板上，使其厚度约为3mm，冷却后即成琼脂板（注意这里所用缓冲液的离子强度必须比电泳时的离子强度高1倍）。
3、点样 加样方法二：一是挖槽法，在琼脂板的中央挖一长方形小槽，将在水浴上熔化至42~45℃的琼脂与样品等量混合，倒入小槽中，也可直接将样品倒入小槽中；另一种是滤纸插入法，在琼脂板上适当的位置用刀片切一裂缝，插入蘸有样品的厚滤纸片，纸片的宽度与琼脂板厚度一致。样品浓度一般以4%~5%为宜。
4、电泳 加样完毕后，将琼脂板轻轻放在电泳槽上，两端用几层滤纸与电极槽缓冲液连接。接通电源，调节电压。一般电场强度为6V/cm。
5、固定和染色 将电泳后的琼脂板浸入70%酒精配制的2%醋酸溶液中15~20分钟进行固定。固定后的琼脂板，需用自上而下为水漂洗数次，然后放在40℃左右的烘箱中烘干，这时琼脂板成一薄膜，附于玻璃板上，再以适当的显色剂显色。
五、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰凝胶电泳（PAGE）是根据被分离物质所带来的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。它具有电泳和分子筛的双重作用。
1、聚丙烯酰胺的聚合 丙烯酰胺单体和交联剂N1N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧键的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。
常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）有以下两种：
（1）过硫酸铵-TEMED（四甲基乙二胺）系统 在Acr和Bis的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在pH8.8条件下7%的丙烯酰胺溶液30分钟就能聚合完毕；在pH4.3时聚合很慢，要90分钟才能完成。温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升高聚合更快。如将混合后的凝胶溶液放在0℃的地方，就能延缓聚合。一般来讲，温度过低，有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气，然后再混后。
（2）核黄素-TEMED系统 这是一个光激发的催化反应。核黄素在光照下分解，黄素被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。核黄素催化系统的优点是：①用量少（1mg/100mL），对所分析的样品没有任何影响；②聚合作用所用的时间可以自由控制，变化光照时间、强度，可使聚合延缓或加速。而过硫酸铵-TEMED系统的聚合作用所需的时间除了取决于温度、pH及有氧分子或不纯物质的存在外，还取决于它们的浓度。为了使分析的结果重复性高，核黄素催化系统的光照时间和强度最好标准化。
凝胶的机械强度和弹性是很重要的。凝胶的软硬、透明度、粘着度都会直接影响分离的效果。凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度和Acr与Bis两者之比。
其中a：b（W/W）是很关键的。当a：b〈10时，凝胶变脆、变硬、呈乳白色时，a：b〉100时，5%的凝胶呈糊状，也易断裂。欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制a：b=30左右。不同浓度的单体对凝胶性质也有影响，发现Acr低于2%，Bis在0.5%以下就不能聚合了。当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。通常T为2%~5%时，a:b=20左右；T为15%~20%时， a:b=125~200。
用于研究大分子核酸的凝胶多为T=2.4%的大孔径凝胶，因为太软不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加入20%蔗糖也可增加其机械强度而不影响其孔径大小。至于粘着度，一般来说只要容器内壁干净，单体浓度适中，凝胶与器壁粘着附着力较大，随存放时间的延长附着力降低,有时在电泳结束时一部分胶柱就可能从管壁上滑脱出来。
2、聚丙烯酰胺凝胶的孔径 聚丙烧酰胺凝胶在电泳中不仅有防止对流，减低扩散的能力，而且还具有分子筛的作用，这是因为聚丙烯酰胺凝胶是一个三维空间网状结构。某一个分子通过这种网孔的能力显然取决于凝胶孔径的大小和形状，也取决于被分离物质的大小和形状。因此，当所分离的物质不时，凝胶越浓，孔径越小，所受阻力也就越大。
推算凝胶孔径的几种方法：
（1）p=Kd/√c
式中：p为孔径的平均直径；
c为多聚体浓度；
d为多聚体分子直径，若不是卷曲的分子应为0.5nm
K为常数,取决于凝胶的几何构型。假若多聚体的链是以近直角交联的，则约为1.5。
以5%凝胶为例可计算出其孔径平均直径为3.8nm.这样的计算是粗略的,与实际情况尚有一定的距离.
(2)有人计算7.5%凝胶孔径的平均直径为5nm,30%的为2mn左右.
(3)有人利用颗粒状聚丙烯酰胺凝胶做色层分析,测定了总浓度(T)为6.5%~20%的丙烯酰胺凝胶液在6种不同比例的双丙烯酰胺存在时聚合后的孔径大小。孔径的大小很大程度上取决于两者的总浓度(T)。T值增大，孔径相应变小，机械强度增强。值得注意的是当T值不变时，Bis浓度在5%时孔径最小，高于或低于5%孔径却相应变大，因此就可能有这样的现象出现：当Bis浓度在5%以上或以下时，尽管T值很大，但却比T值小而Bis为5%时的孔径要大。
分离蛋白质的实践证明，胶的孔径大约是蛋白质分子平均大小的一半时分析结果较好。例如，肌红蛋白和细胞色素分子的半径为2nm，那么可选择平均胶孔半径为1nm的凝胶度。因此，在实用中常按样品的相对分子质量(Mr)大小来选择适宜的凝胶孔径,如下表。
不同相对分子质量（Mr）范围所选用的凝胶浓度百分率
常用的所谓标准胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此胶中电泳都能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4%~10%的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。
3、缓冲系统的选择 在选择缓冲系统时主要从以下两方面来考虑：
（1）、pH范围、离子种类和离子强度 对蛋白质来说，选择pH值应能使样品中各种蛋白质分子泳动率的差别最大。酸性蛋白质在高pH条件下，碱性蛋白质在低pH条件下常得到较好的分离效果。如果蛋白质样品经电泳分离后，还希望测定其生物活性，则缓冲系统的pH值不应过大或过小（大于pH9左右或小于pH4），否则会引起蛋白质活性的钝化。目前常用的分离胶缓冲系统有高pH（pH9左右）、低pH（Ph4左右）和中性三大类。此外，通常选用离子强度较低的缓冲溶液（0.01~0.1mol/L）。因为离子强度低，电泳分离过程短，产生的热量也较小,分离效果好。
（2）、连续和不连续系统 所谓连续系统是指电泳槽中的缓冲系统和pH值与凝胶中的相同，不连续系统是槽中与凝胶中的缓冲系统的分辨率较高。
4、不连续盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续盘状电泳往往包含两种以上的缓冲溶液，pH和凝胶孔径。多用于分析浓度较稀的样品。一般是在内径为0.7cm,长10cm的小玻璃管内，把3种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来。包括①样品胶(其中含有样品)；②浓缩胶(又名成层胶)，这两种胶的缓冲液，pH和孔径大小完全一样，③分离胶(又称电泳胶)，其孔径一般比浓缩胶小，pH值也不同；样品胶和浓缩胶是T=3%,C=20%的单体溶液在Tris-HCI缓冲液中由核黄素催化合成的大孔胶,Ph6.7.而分离胶是由T=7%,C=2.5%的单体溶液在Tris-HCI缓冲液(pH8.9)中通过过硫酸铵催化聚合成的小孔胶。将含有这3种凝胶的玻璃管放在含有Tris-甘氨酸(pH8.3)缓冲液的电泳槽内进行电泳，就是不连续的盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。它之所以有很高的分辨率是因为有3种效应：即浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
浓缩效应：样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，甚至有的能浓缩几百倍。为什么样品会在浓缩胶中中被压挤成层呢？这是因为样品胶和浓缩胶是用pH6.7的Tris-HCI缓冲液制成；电泳时,由于HCI解离度大,几乎全部释放出CI离子，而在电泳槽中的Tris-甘氨酸缓冲液是pH8.3,因为甘氨酸的等电点为6.0，在电泳过程中，它只有极少数分子(1%~0.1%)解离成H2N-CH-COO离子。一般酸性蛋白质在此pH值下也解离为带负电荷的离子,但其解离度比HCI小，比甘氨酸大。这3种离子带有同性电荷,在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的。而且它们的有效泳动率是按下列次序排列的，即:mCLaCL>m蛋a蛋〉m甘a甘。
m为泳动率；a为解离度；ma为有效泳动率。
根据有效泳动率的大小，最大称为快离子(或先行离子，这里是CI离子)，最小的称为慢离子(或随后离子,这里是H2N-CH-COO离子)。电泳开始时3种凝胶中都含有快离子,只有电泳槽中的缓冲液含有慢离子。电泳开始后，由于快离子的泳动率最大,在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电导与电势梯度是成的比的:
E=（I/η）（V/cm）
E为电势梯度；I为电流密度；n为电导率。
所以低电导区就产生了较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度区和低电势梯度区和代电势梯度区之间形成一个迅速移动的界面。由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好介于快、快离子之间，所以也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。
电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带，但由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状蛋白质区带。
分子筛效应：当蛋白质通过浓缩胶进入分离胶时，由于pH和凝胶孔径突然改变（选择分离胶的pH为8.9,电泳时经实际测量为pH9.5）,使甘氨酸的解离度增大,因而它的有效泳动率也增加,此时甘氨酸很快就赶上并超过了蛋白质分子，这样高电势梯度不存在了，使蛋白质样品进入一个均一的电势度和pH条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，相对分子质量(Mr)或构型不同的蛋白质通过分离胶，所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的泳动率，即所谓的分子筛效应在分离胶中被分开。
聚丙烯酰胺凝胶电泳除具有分子筛作用以外,还具有下面一些优点:
(1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的凝胶，可以通过调节控制单体浓度或单体和交联剂的比例，形成不同程度的交联结构，很容易得到孔径大小，范围广泛的凝胶，所以实验重复性很高。
(2)聚丙烯酰胺形成的凝胶，机械强度好，弹性大，便于电泳后的一切处理。
(3)聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳的多聚体，只带有不活泼的酰胺基侧链，没有其他离子基团，因而几乎没有电渗作用。并且不与样品相互作用。
(4)在一定范围内，聚丙烯酰胺对热是稳定的，凝胶无色透明，易于观察，可用检测仪直接测定。
(5)设备简单，所需样品量小(1~100ug),而分辨率高.在超微量分析中,能检出含量在10-9~10-12g的样品。
(6)用途广泛,对生物高分子化合物(如蛋白质、酶、多核酸)能进行分离鉴定。又可用于毫克水平的制备。
目前广泛应用于分子生物学、生物化学、细胞学、微生物学、植物学、动物学、免疫学等学科的研究以及临床化验。
第二篇 学 生 实 验
实验一 蛋白质的性质实验
一、蛋白质等电点的测定
1、目的
（1）了解蛋白质的两性解离性质。
（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。
2、原理
蛋白质是两性电解质。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3、器材
（1）水浴锅 （2）温度计 （3）200mL锥形瓶
（4）100mL容量瓶 （5）吸管 （6）试管
（7）试管架 （8）乳钵
4、试剂
（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 200mL
取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200 mL锥形瓶内，用少量40～50℃的温水先洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL1mol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放入到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
(2) 1.00mol/L醋酸溶液 100mL
（3）0.10mol/L醋酸溶液 100mL
（4）0.01mol/L醋酸溶液 50mL
5、操作
（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀①。
(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL,加一管,摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
二、蛋白质的沉淀及变性
1、目的
（1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
（3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。
2、原理
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质深沉与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
3、试剂与材料
（1） 蛋白质溶液 500mL
5% 卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水）=（1：9）
（2） pH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲溶液 100错误！链接无效。
（3） 3%硝酸银溶液 10错误！链接无效。
（4） 5%三氯乙酸溶液 50错误！链接无效。
（5） 95%乙醇 250错误！链接无效。
（6） 饱和硫酸铵溶液 250错误！链接无效。
（7） 硫酸铵结晶粉末 1000g
（8） 0.1mol/L盐酸溶液 300错误！链接无效。
（9） 0.1mol/L氢氧化钠溶液 100错误！链接无效。
（10） 0.05mol/L碳酸钠溶液 100错误！链接无效。
（11） 0.1mol/L醋酸溶液 100错误！链接无效。
（12） 甲基红溶液 20错误！链接无效。
（13） 2%氯化钡溶液 150错误！链接无效。
4、操作
（1）蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
由盐析获得的蛋白质深沉，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加5%卵清蛋白溶液5错误！链接无效。于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加水量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
（2）重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管，加入蛋白质溶液2错误！链接无效。,再加3%硝酸银溶液1~2滴,振荡试管,有沉淀产生。放置片刻,倾去上清液，向沉淀中加入少量的水,沉淀是否溶解?为什么?
(3)某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管,加入2错误！链接无效。蛋白质溶液,再加入1错误！链接无效。5%三氯乙酸溶液,振荡试管,观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液,向沉淀中加入少量水,观察沉淀是否溶解。
(4)有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2错误！链接无效。蛋白质溶液，再加入2错误！链接无效。 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
(5)乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：
振摇混匀后,观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8错误！链接无效。，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L溶液数滴,观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。
实验二 牛乳中蛋白质的提取与鉴定
一、 原理
牛乳和羊乳中含丰富的蛋白质，其中主要是酪蛋白。酪蛋白在羊乳罩中约占总蛋白量3/4，牛乳中约占总蛋白量的5/6。酪蛋白是一种含磷蛋白的不均一混合物。
蛋白质在其等电点pH溶液中溶解度降底。根据这个原理，将牛乳的PH调整至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀出来。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鉴定。
除去酪蛋白的滤液中，尚含有球蛋白，清蛋白等多种蛋白质。
试剂
1、醋酸钠缓冲液(0.2M pH4.6)。
2、米伦(Millon)试剂:将汞100g溶于140ml(比重1.42)的浓硝酸中(在通风橱内进行)。然后加两倍量的蒸馏水稀释。
3、95%乙醇
4、乙醚.
5、10%NaGl.
6、0.5%NaGO
7、0.1NaON
8、0.2%HC1.
9、饱和氢氧化钙［Ca(OH)］
10、5%醋酸铅
操作
(一)酪蛋白的制备 取新鲜牛乳100ml，放入250 ml烧杯中加热至40℃.加入100ml加热至同样温度的醋酸缓冲液，一边加一边摇动，并用pH为4.7(用1%NaOH或10%醋酸进行调整)。冷却至室温，继续放置5分钟,然后用细纱布或滤纸过滤。滤液为乳清保留以下做鉴定。过滤所得沉淀物,用少量蒸馏水洗几次，过滤。将洗净的沉淀物悬浮在约30ml乙醇中，用布氏漏斗抽滤。所得沉淀用乙醇和乙醚等量混合液洗涤两次，抽干。最后用50ml乙醚洗一次并抽干。取出抽干的粉状物，摊开在表面皿上，使乙醚完全挥发。称其干重计算其产量。
(二)酪蛋白的性质鉴定
1.溶解度:取试管6支,分别加水、10%氯化钠、0.5%氯化钠，0.1N氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙溶液各2ml。于每管中加入少量酪蛋白。不断摇荡，观察并记录各管中的酪蛋白溶解度。
2、米伦反应1：取酪蛋白少许，放置于试管中。加入1ml蒸馏水，再加入米论试剂10滴，振摇，并徐徐加热。观察其颜色变化。
3、含硫（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）测定：取少量酪蛋白溶于1ml 0.1N NaOH溶液中，再加入1-3滴5%醋酸铅，加热煮沸，溶液变为黑色。
(三)乳清中可凝固性蛋白质的鉴定 将制备酪蛋白时所得的滤液移入烧杯中，徐徐加热。即出现蛋白质沉淀。此为乳清中的球蛋白和清蛋白。
注附：米伦反应是由于蛋白质分子中有羟基苯基(-CH-OH)存在之故.一些在3.5位置上没有取代基的酚类化合物,例如酪氨酸、酚及?香酚也呈阳性反应。在蛋白质分子中，只有酪氨酸才具有羟基苯基，所以蛋白质对米伦试剂起阳性反应。
实验三 氨基酸的分离鉴定??纸层析法
一、目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：
R=原点到层析点中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、器材
1、层析缸① 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿
5、层析滤纸（新华一号）
四、试剂
1、扩展剂
是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用.
2、氨基酸溶液 0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。各5mL
3、显色剂 50~100mL
0.1%水合茚三铜正丁醇容液。
五、操作
1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2、取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一条直线，在此直线上第间隔2cm作一记号如右图。
3、点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。
4、扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿建迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需你于点样线1cm）。待溶剂上升15~20cm时即取出滤纸，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5、显色 用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6、计算各种氨基酸的Rf值。
思考题
1、何谓纸层析法？
2、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？
3、怎样制备扩展剂？
4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？
实验四 酶的特性
一、目的
加深对酶的性质的认识
二、内容
本实验由温度对酶活力的影响；PH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制；酶的专一性4组实验组成。
（一）温度对酶活力的影响
1、原理
酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37~40℃，植物酶的最适温度为50~60℃。
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。
低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。
2、器材
（1）试管及试管架 （2）恒温水浴 （3）冰浴 （4）沸水浴
3、试剂和材料
（1）0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液 150 mL
需新鲜配制
(2)稀释200倍的唾液 50 mL
用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释200倍(稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整)，混匀备用。
(3)碘化钾-碘溶液
将碘化钾20g及碘10g溶于100mL水中。使用前稀释10倍。
4、操作
淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
取3支试管，编号后按下表加入试剂：
摇匀后，将1、3号两试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出（将2号管内液体分为两半），用碘化钾一碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何？
（二）pH对酶活性的影响
1、原理
酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。
2、器材
（1）试管及试管架 （2）吸管
（3）滴管 （4）50mL锥形瓶
（5）恒温水浴
3、试剂和材料
（1）新配制的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液 250 mL
(2)0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 100 mL
(3)0.1mol/L磷酸氢二钠溶液 600 mL
(4)0.1mol/L柠檬酸溶液 400 mL
(5)碘化钾-碘溶液 50 mL
(6)pH试纸 pH=5、pH=5、pH=6.8、pH=8四种
4、操作
取4个标有号码的50 mL锥形瓶。用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0~8.0的4种缓冲液。
从4个锥形瓶中各取缓冲液3 mL，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2 mL和稀释200倍的唾液2mL。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。
待向第4管加入唾液2分钟后,每隔1分钟由3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾一碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1~2滴碘化钾一碘溶液。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1分钟。
观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。
(三)唾液淀粉酶的活化和抑制
1、原理
酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。
2、器材
（1）恒温水浴 （2）试管及试管架
3、试剂和材料
（1）0.1%淀粉溶液 150 mL
(2)稀释200倍的新鲜唾液 150 mL
(3)1%氯化钠溶液 50 mL
(4)1%硫酸铜溶液 50 mL
(5)1%硫酸钠溶液 50 mL
(6)碘化钾-碘溶液 100 mL
4、操作
*保温时间可根据个人唾液淀粉酶活力调整。
解释结果,说明本实验第3管的意义。
（四）酶的专一性
1、原理
酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。
淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用Benedict试剂检查糖的还原性。
2、器材
（1）恒温水浴 （2）沸水浴
（3）试管及试管架
3、试剂和材料
（1）2%蔗糖溶液 150 mL
（2）溶于0.3%氯化钠的1%淀粉溶液(需新鲜配制) 150 mL
(3)稀释200倍的新鲜唾液 100 mL
(4)蔗糖酶溶液 100 mL
将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2~3次(离心法),然后放在滤纸上自然干燥.取干酵母100g，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨提取约1小时，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。
(5)Benedict氏试剂
无水硫酸铜17.4g溶于100 mL热水中，冷却后稀释到150 mL。取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600 mL水共热，溶解后冷却并加水至850 mL。再将冷却的150 mL硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。
4、操作
（1）淀粉酶的专一性
解释实验结果（提示：唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶）。
（2）蔗糖酶的专一性
解释实验结果。
思考题
1、什么是酶的最适温度及其应用意义？
2、什么是酶反应的最适pH？对酶活性有什么影响？
3、什么是酶的活化剂？
4、什么是酶的抑制剂？与变性剂有何区别？
本实验结果如何证明酶的专一性？
实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
一、目的
了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的主法。
二、原理
酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
三、器材
1、乳钵 2、150mol/L锥形瓶
3、水浴 4、量筒
5、布氏漏斗及抽滤瓶 6、吸管
7、滴管 8、试管及试管架
9、烧杯 10、离心机
11、漏斗
四、试剂和材料
1、0.04mol/L氢氧化钠溶液 1000 mL
2、酸性乙醇溶液 500 mL
将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。
3、95%乙醇 1000 mL
4、乙醚 500 mL
5、1.5mol/L硫酸溶液 200 mL
6、浓氨水 50 mL
7、0.1mol/L硝酸银溶液 50 mL
8、三氯化铁浓盐酸溶液 80 mL
将2 mL 10%三氯化铁溶液（用FeCl3·6HO配制）加入到400 mL浓盐酸中。
9、苔黑酚乙醇溶液 10ML
溶解6g苔黑酚于100 mL 95%乙醇中（可在冰箱中保存一个月）。
10、定磷试剂
（1）17%硫酸溶液 将17 mL浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 mL水中
(2)2.5%钼酸铵溶液 将2.5g钼酸铵溶于100 mL水中.
(3)10%抗坏血酸溶液 10g抗坏血酸溶于100 mL水中,贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用,如呈深黄或棕色则失效,需纯化抗坏血酸。
临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。
17%硫酸溶液:2.5%钼梭铵溶液:10%抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2(V/V)。
11、酵母粉
五、操作
将15g酵母悬浮于90 mL 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移到150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾入30 ML酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次，乙醚涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。
取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10 mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定.
1、嘌呤碱 取水解液1支试管液1 mL加入过量浓氯水，然后加入约1 mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。
2、核糖 取1支试管加入水解液1 mL、三氯化铁浓盐酸溶液2 mL和苔黑酚乙醇溶液0.2 mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
3、磷酸 取1支试管，加入水解液1 mL和定磷试剂1 mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。
思考题
1、如何得到高产量RNA的粗制品？
2、本实验RNA组分是什么？怎样验证的？
实验六 紫外分光光度法测定核酸的含量
一、目的
1、了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
2、学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。
二、原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外吸收高峰在A260nm波长处。一般在A260波长下，每mL含1ugRNA溶液的光吸收值为0.020。故测定未知浓度RNA或DNA溶液A260nm波长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法预除去。
三、器材
1、分析天平 2、离心机
3、容量瓶 4、紫外分光光度计
5、吸管 6、冰浴或冰箱
四、试剂
1、5%~6%氨水
2、钼酸铵-高氯酸试剂（沉淀剂）。如配制200mL可在193mL蒸馏水中加入7mL70%高氯酸和0.5g钼酸铵。
五、操作
1、用分析天平准确称取待测的核酸样品500 mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。然后用5%~6%氨水调至pH7，定容到50mL。
2、取2支离心管，向第一支管内加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水；向第二支管内加入2mL样品溶液和2mL溶淀剂，以除去大分子核酸作为对照。混匀。在冰浴或冰箱中放置30分钟后离心（3000r/min，10分钟）。从第一管和第二管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容到50mL。用光程为1cm的石英比色杯，于260nm波长处测其光吸收值（A1和A2）。
六、计算
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液（20~50kg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。
实验七 维生素C的定量测定
一、目的
1、学习维生素C定量测定法的原理和方法。
2、进一步熟悉、掌握微量商定法的基本操作技术。
二、原理
测定维生素C（抗坏血酸）的化学方法，一般是根据它的还原性。本实验即利用维生素C的这一性质，使其与2,6-二氯酚靛酚作用。
2,6-二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈蓝色，在酸性环境中为玫瑰色，当其被还原时，则脱色。
根据上述反应，得用2,6-二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有维生素C的样品溶液。开始时，样品液中的维生素C立即将滴入的2,6-二氯酚靛酚还原脱色，当样品液中维生素C全部被氧化时，再滴入的2,6-二氯酚靛酚就不再被还原脱色而呈玫瑰色。故当样品液用2,6-二氯酚靛酚标准液滴定时，溶液出现浅玫瑰色时表明样品液中的维生素C全部被氧化，达到了滴定终点。此时，记录滴定所消耗的2,6-二氯酚靛酚标准液量，按下述公式计算出样品液中还原型维生素C的含量。
计算公式：
维生素C mg数/100g样品＝
式中：
为滴定样品提取液所用的2,6-二氯酚靛酚的平均mL数；
VB为滴空白对照所用的2,6-二氯酚靛酚的平均mL数；
S为1mL2,6-二氯酚靛酚溶液相当于维生素C的mg数；
W为10mL 样品提取液中含样品的g数。
三、器材
1、研钵 2、吸量管（10mL）
3、容量瓶（50mL） 4、锥形瓶（50mL）
5、微量滴定管理（5mL） 6、漏斗
7、纱布 8、滤纸
9、药物天平
四、试剂和材料
1、绿豆芽 800g
2、10%盐酸溶液 1500mL
3、2,6-二氯酚靛酚溶液 2000mL
称取0.21g碳酸氢纳，0.26-二氯酚靛酚溶于250mL蒸馏水中，稀释至1000mL。过滤，装入棕色瓶内，置冰箱内保存，不得超过3天。使用前用新配制的标准抗坏坏血酸溶液标定。取5mL标准抗坏血酸溶液加入5mL偏磷酸-醋酸溶液。然后用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定，以生成为微玫瑰红色持续15秒钟不退为终点。计算2,6-二氯酚靛酚溶液的浓度，以每mL2,6-二氯酚靛酚溶液相当于抗坏血酸的mg数来表示。
4、标准抗坏血酸溶液
准确称取纯抗坏血酸结晶50mg溶于偏磷酸-醋酸溶液定容到250mL。装入棕色瓶，贮于冰箱内。
5、偏磷酸-醋酸溶液
称取偏磷酸15g，溶于40mL冰醋酸和450mL蒸馏水所配成的混合液中。过滤。贮于冰箱内，此液保存不得超过10天。
五、操作
制备含维生素C的样品提取液。
称取30g绿豆芽（37℃发芽3?7天）置研钵中研磨，放置片刻（约10分钟），用2层纱布布过滤，将滤液（如混浊可离心）滤入50mL容量瓶中。反复抽提2?3次。将滤液并入同一容量瓶中。最后，用酸化的蒸馏水定容，混匀，备用。
量取样品提取液10mL于锥形瓶中。用微量滴定管，以2,6-二氯酚靛酚溶液滴定样品提取液，呈微弱的玫瑰色，持续5秒钟不退为终点，记录所用2,6-二氯酚靛酚的mL数。整个滴定过程不要超过2分钟。
另取10mL用10%盐酸化的蒸馏水做空白对照滴定。
样品提取液和空白对照各做三份。
计算结果。
思考题
试述本实验介绍的2,6-二氯酚靛酚滴定法的优缺点。
（附）磺滴定法
原理
铜盐（硫酸铜或醋酸铜）与过量的碘化钾进行反应形成碘化铜。碘化铜不稳定，随即分解为碘化亚铜和游离的碘。
释放出来的碘可氧化L-抗坏血酸形成脱氢抗坏血酸和碘化氢。反应继续进行，直到溶液里的L-抗坏血酸被碘全部氧化为止。剩余的微量的碘与淀粉指示剂生成蓝色，终点明显。本法简单，快速，可准确测定L-抗坏血酸
的量。对抗坏血酸纯品进行测定的结果表明实验误差不超过
。
试剂
（1）标准0.01mo1/L硫酸铜（
）溶液或0.01mol/L醋酸铜［Cu(CH2COO)2·H2O］溶液：精确称取0.2497g硫酸铜或0.1996g醋酸铜加水定容至100mL。
（2）30%和50%碘化钾水溶液（W/V）
（3）1%可溶性淀粉指示剂溶液（W/V）
（4）偏磷酸－醋酸溶液 取15g偏磷酸溶于40mL冰醋酸和450mL蒸馏水的混合液中，在冰箱中过滤，滤液保存在冰箱中，超过10天需重新配制。
操作
1、测样准备
（1）药品片剂 取10个药片称重，小心研碎，精密称取相当于1片重量的片粉，以偏磷酸-醋酸溶液溶解，于100mL量瓶中定容，摇匀后过滤。
（2）注射液 取1mL注射液用偏磷酸-醋酸溶液稀释定容到100mL。
（3）食品 取50g或20g蔬菜或水果，加偏磷酸-醋酸溶液到200mL，搅匀3分钟后过滤，滤液放入碘量瓶中。
2、滴定 精确量取一定体积的样品溶液（如5mL）于100mL磺量瓶中，加10mL30%KI溶液（抗坏血酸稀溶液含量低于1mg时可用50%KI溶液）。再加数滴淀粉指示剂溶液。随即用标准硫酸铜溶液（0.01mol/L）进行滴定。边滴定边振摇，直至显示出蓝色，记录滴定量。再做一个空白试验，在计算前，需将样品的滴定量减去空白试验的滴定量得V。
计算
L-抗坏死血酸含量（mg/每份）＝
V＝0.01mol/L标准硫酸铜溶液的mL数。
C=0.88即1mL0.01mol/L标准硫酸铜溶液相当于0.88mg抗坏血酸。
实验八 血糖的定量测定
??GOD-PAP法
一、目的
学习用GOD-PAP法测定血糖含量。
二、原理
动物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情况下，其含量较恒定。健康家兔的血糖水平为80-120mg/dL。
GOD-PAP法，即过氧化物酶-抗过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定普遍采用的方法。该法测定血糖依据的酶反应为：
葡萄糖
氨基安替比林＋酚
醌亚胺＋
醌亚胺在A480nm~A550nm波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。在同样条件下，测定葡萄糖标准液和样品的光吸收值，代入后面所给的公式即可求出样品中葡萄糖的含量。
三、器材
1、试管 2、试管架
3、恒温水浴 4、721型分光光度计
5、0.1mL微量吸血管
四、试剂和材料
1、血糖试剂盒
北京中生生物工程高技术公司产品。
酶试剂：葡萄糖氧化酶（GOD） ＞
过氧化物酶（POD） ＞
磷酸缓冲液：磷酸盐 
酚 
4-氨基安替比林 
葡萄糖标准液 
使用时，将90mL磷酸缓冲液与10mL酶制剂混匀即可。称此混匀的溶液为工作液。每一剂盒装有2瓶磷酸缓冲液和2瓶酶制剂。
2、样品（兔血清） 6mL
五、操作
取3支试管，按下列加入试剂。
分别将各试管内容物摇匀，37℃保温10－15分钟（避免阳光直射）用光程为1.0cm的比色环，在A480nm-A550nm波长进行比色。将测行的A标准、A样品数据代入下述公式，计算出样品中葡萄糖的浓度。
式中：
c为样品中葡萄糖的浓度；
A标准为葡萄标准液在A480nm-A550nm波长的光吸收值；
A样品为待测样品在A480nm-A550nm波长的肖吸收值；
C标准为葡萄糖标准液中葡萄糖的浓度。
实验九 脂肪酸的β－氧化
一、目的
了解脂肪酸的
－氧化作用。
二、原理
在肝脏中，脂肪酸经－氧化作用生成乙酰辅酶A。2分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成－羟丁酸。乙酰乙酸、－羟丁酸和丙酮总称为酮体。
本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生存的丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。反应式如下：
2NaOH+I2 NaOI+NaI+H2O
CH3COCH3+3NaOI CHI3+CH3COONa+2NaOH
碘仿
剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠溶液滴定。
NaOI+NaI+2HCl I2+2NaCl+H2O
I2+2Na2S2O3 Na2S4O6+2NaI
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
三、器材
1.5ml微量滴定管 2.恒温水浴
3.吸管 4.剪刀及镊子
5.50ml锥形瓶 6.漏斗
7.试管及试管架
四、试剂和材料
1、家兔（或鲜猪肝） 一只
2、0.1%淀粉溶液 20ml
3、0.9%氯化钠溶液 200ml
4、0.5mol/L丁酸溶液 150ml
取5ml丁酸溶于100ml0.5mol/L氢氧化钠溶液中。
5、15%三氯乙酸溶液 200ml
6、10%氢氧化钠溶液 150ml
7、10%盐酸溶液 150ml
8、0.1mol/L碘溶液 200ml
称取12.7g碘和约25g碘化钾溶于水中，稀释到1000ml，混匀，用标准0.05mol/L硫代硫酸钠溶液标定。
9、标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液稀释成0.01mol/L。
10、1/15mol/LpH7.6磷酸盐缓冲液 200ml
mol/L磷酸氢二钠86.8ml与mol/L磷酸二氢钠13.2mL混合。
五、操作
1、肝糜制备 将家兔颈部放血处死，取出肝脏。用0.9%氯化钠溶液洗去污血。用滤纸吸去表面的水分。称取肝组织5g置研钵中。加少量0.9%氯化钠溶液，研磨成细浆。再加0.9%氯化钠溶液至总体积为10ml。
2.取2个50ml锥形瓶，各加入3mL1/15 mol/LpH7.6的磷酸盐缓冲液。向一个锥形瓶中加入2mL正丁酸，另一个锥形瓶作为对照，不加正丁酸。然后各加入2mL肝组织糜。混匀，置于43℃恒温水浴内保温。
3.沉淀蛋白质 保温1.5小时后，取出锥形瓶，各加入3mL15%三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加2mL正丁酸，混匀，静置15分钟后过滤。将滤液分别收集在2支试管中。
4.酮体的测定 吸取2种滤液各2mL分别放入另2个锥形瓶中，再各加3mL0.1mol/L碘溶液和3mL10%氢氧化钠溶液。摇匀后，静置10分钟。加3mL10%盐酸溶液中和。然后用0.01mol/L标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘。滴至浅黄色时，加入3滴淀粉溶液做指示剂。摇均，并继续滴到蓝色消失。记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠溶液的mL数，并按下式计算样品中丙酮含量。
5.计算
肝脏的丙酮含量（mmol/g）＝（A－B）×CNa2S2O3×
式中：
A为滴定对照所消耗的0.01mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数；
B为滴定样品所消耗的0.01mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数。
CNa2S2O2为标准硫代硫酸钠溶液浓度（mol/L）。
实验十 DNA的琼脂糖凝胶电泳
（一）实验目的
1、了解琼脂糖凝胶电泳的原理和使用范围。
2、了解琼脂糖凝胶电泳的操作技术。
（二）实验内容与基本要求
本实验用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，其主要内容包括制胶，加样，电泳，染色及拍照。
（三）主要仪器设备及器材
1、设备：电泳仪、水平式电泳槽、紫外线透射仪、凝胶成像系统。
2、器材：DNA 、琼脂糖 、微量加样器、微量离心管、溴酚蓝。
（四）操作
1、琼脂糖凝胶的制备
以稀释的电泳缓冲液（0.5×TBE溶液）为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶。将胶槽两端分别用透明胶紧密封住。将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。待溶胶冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB，摇匀，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却，撕去两端的透明胶，拨出梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面。
2、样品配制与加样
取2 μL RNA样品，用电泳缓冲液稀释RNA样品，加1/5体积的6×溴酚蓝指示剂，混均后，点样，记录样品次序与点样量。
3、电泳
打开电泳仪的电源开关。最高电压不超过5V/cm，当琼脂糖浓度低于0.5%，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。琼脂糖凝胶分离大分子核酸实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。
4、观察和拍照
在紫外透射仪下观察RNA条带，用拍照，或用凝胶成像系统输出照片。通过比较样品与一系列标准样品的荧光强度，可估算出待测样品的浓度。观测RNA区带，检测总RNA的质量。
5、注意事项与提示
1）溴化乙啶具有强烈的致癌作用，操作时应带手套，应避免污染实验高压台面。
2）溴化乙啶在紫外光源上放置时间过长，荧光将会猝灭。
3)紫外线对人体有损害，对眼睛尤甚，操作时应注意有效防护。
实验十一 蛋白质的透析
一、目的
学习透析的基本原理和操作。
二、原理
蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。
在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。
三、器材
1、透析管或玻璃纸 2、烧杯
3、玻璃棒 4、电磁搅拌器
5、试管及试管架
四、试剂
1、蛋白质的氯化钠溶液 3个除去卵黄的鸡卵蛋清与700mL水及300mL饱和氯化钠溶液混合后，用数层干纱布过滤。
2、10%硝酸溶液
3、1%硝酸银溶液
4、10%氢氧化钠溶液
5、1%硫酸铜溶液
五、操作
1、用蛋白质溶液作双缩脲反应。
2、向火棉胶制成的透析管中装人10~15mL蛋白质溶液并放在盛有蒸馏水的烧杯中(作法见第二章，或用玻璃纸装入蛋白质溶液后扎成袋形,系于一横放在烧杯的玻璃棒上)。
3、约1小时后，自烧杯中取水1~2mL，加10%硝酸溶液数滴使成酸性，再加入1%硝酸银溶液1~2滴，检查氯离子的存在。
4、从烧杯中另取1~2mL水，做双缩脲反应，检查是否有蛋白质存在。
5、不断更换烧杯中的蒸馏水（并用电磁搅拌器不断搅动蒸馏水）以加速透析过程。数小时后从烧杯中的水中不能再检出氯离子。此时停止透析并检查透析袋内容物是否有蛋白质或氯离子存在（此时应观察到透析袋中球蛋白沉淀的出现，这是因为球蛋白不溶于纯水的缘故）。
实验十二 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳??血清蛋白的分离
一、目的
了解聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的基本原理和操作技术。
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂和加速剂的作用下发生聚合反应而制得的。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度来加以控制。一般分离蛋白质选用7.5%聚丙烯酰胺凝胶，分离比较大的分子，如核糖体核酸时则用2.5%凝胶。
凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用其分辨力较高。
三、器材
1、电泳议（600V）及盘状电泳槽
2、电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径5~7mm，长80~100mm
3、玻璃架（制胶时用来垂直插放玻璃管）
4、微量注射器或微量吸管
5、带长针头的注射器
6、日光灯
7、带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管
四、试剂和材料
1、血清
2、贮液和工作溶液 按下表配制
贮液及工作溶液的配制
①贮液放冰箱中一般可保存1~2月,3号贮液只能保存一周。如有不溶物要过滤。
表中试剂:Acr??丙烯酰胺：Bis??亚甲基双丙烯酰胺；TEMED??四甲基乙二胺；Tris??三羟甲基氨基甲烷。
五、操作
一般先制分离胶，再在分离胶上面制作浓缩胶。
1、分离胶的制备 将贮液由冰箱取出，待达到室温后再按上表中的比例配制工作溶液。先将分离胶液与过硫酸铵溶液分别放在真空干燥器中。待抽出溶解的空气后取出，赶快混匀，用带长针的注射器吸取一定量的胶液，沿着管壁加到预先准备好的玻璃管中（玻璃管的一端用带有玻璃珠或小段玻璃棒的乳胶管塞住,在乳胶管中加2滴40%蔗糖后插在玻璃架上），灌入的分离胶液高约6.5cm，然后立即用带弯针头的小注射器在已加入的分离胶液面上，距胶面约0.1 cm 处沿管壁缓缓加入3~ 5mm高的蒸馏水层，切忌使加入之水呈滴状坠入胶液,这样会使顶部凝胶浓度变稀，改变凝胶孔径。
水层放好后，静置胶液使进行聚合反应。正常情况下10分钟开始聚合，应控制在30分钟到1小时内完成聚合。
刚加水时看出有界面，后逐渐消失。等到再看出界面时表明凝胶已经聚合，再静置30分钟使聚合完全。
2、浓缩胶的制备 用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液（滤纸不要接触胶面）。
按此比例混匀浓缩胶液（也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，抽完气后再混合），先用这种胶液很快漂洗一下分离胶的顶部，除去漂洗液后，按上法加入浓缩胶液约0.5 ~ 1cm高，并立即仔细加水层。然后在距管口10cm处用日光灯照射进行光聚合。正常情况下照射6~7分钟就可看到浓缩胶显乳白色，表明聚合开始。继续照半小时，使聚合完全。
除去水层,吸干后用上电极槽缓冲液洗涤，再奖这种缓冲液加至管顶，在室温放置0.5 ~ 1小时就可使用。
浓缩胶应在临用前再制备.
3、加样 盘状电泳所需样品很少，用1mg/mL浓度的样品液每管需5~100ul。
加样前先把玻璃管下边的橡胶塞除去，要注意先拉开乳胶管使空气进入，再拨下来，防止将凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把管固定在上槽的洞中，要保证凝胶管垂直和橡皮塞孔密封不漏。管的下端悬一滴缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。管中凝胶表面上部及上槽均灌满电极缓冲冲液。
将4号贮液1份，水3份，20%蔗糖溶液4份混合，然后取血清3uL，加上述混合液0.15 mL，混匀后小心地加在浓缩胶与电极缓冲液界面处，因样品液比重大，即平铺在凝胶表面。
指示染料一般用溴酚蓝或酚红,通常每管加0.1%的染料溶液0.005 mL,指示染料与样品混合后加入。
4.电泳 加完样后接通电源，负极在上，正极在下。调节电流，开始时用1~2mA/管，电泳1~2分钟，再升高电流到约3~5mA/管，不要一开始电流很高。电流最好不超过5mA，以免产热过多，必要时应进行冷却或在冷库内进行。
当指示染料迁移到凝胶柱的下端附近时就可停止电泳，关闭电源，取出玻管。
缓冲液可再行使用，但上下槽缓冲液不能混淆，因下槽缓冲液中已混入催化剂及氯离子(快离子)，如将它当作上槽液就要影响影电泳效果。
5、凝胶的取出 将一针头长约10cm的注射器吸满水。将针头插入凝胶与管壁之间，并紧贴管壁，一面注入水一面慢慢旋转玻管并推针前进，靠水流压力和润滑作用使玻管内壁与凝胶分开，待水从玻管一端流出时，再慢慢将针头退出。然后去掉针头，用注射器向玻管中快速注水，将凝胶压出玻管。如凝胶浓度较高，取出困难，可用10%的甘油水溶液代替水注入。一般剥胶方向是从浓缩胶端开始。
6、固定 为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需进行固定。方法是把剥出的凝胶柱浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟或浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸液配制的染色液中，同时进行固定和染色。
7、染色 染色的操作过程见下表。
蛋白质的染色法
附:垂直平板电泳
垂直平板电泳有以下优点:
1、一系列样品能在同一块凝胶板上进行电泳，显色条件也相同。
2、平板表面大，有利于凝胶的冷却。
3、易于进行光吸收扫描测定。
实验十三 总RNA的提取及鉴定
一、实验目的
1、学习和掌握提取总RNA的原理和方法；
2、学习和掌握总RNA浓度测定、质量及纯度的鉴定方法；
3、熟悉并掌握琼脂糖凝胶电泳技术与紫外分光光度计的使用方法。
二、实验内容
1、 从细胞或组织中提取总RNA；
2、 总RNA浓度和质量的琼脂糖凝胶电泳检测；
3、 紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度鉴定。
三、实验原理
（一）总RNA的提取
??真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即１）样品细胞或组织的有效破碎；２）有效地使核蛋白复合体变性；３）对内源RNA酶的有效抑制；４）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2)直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相，而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
??一些公司推出的总RNA提取试剂盒（如Gibco公司生产的TRIzol TM试剂），可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂，异硫氰酸胍(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
（二）琼脂糖凝胶电泳技术检测总RNA浓度和质量
??琼脂糖英文名agarose，是由经过挑选、质地较纯的琼脂（agar）作原料制成的。琼脂化学结构上是由琼脂糖和琼脂胶（agaropectin）组成的复合物。琼脂胶是一种含有磷酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质将给电泳及凝胶过滤以不良影响。琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖和琼脂一样也能形成凝胶。形成凝胶主要是由于氢键的缘故。由于琼脂糖具有亲水性及不含带电荷的基团，因此很少引起敏感的生物化学物质的变性和吸附。
琼脂糖凝胶电泳是实验室中最早得到广泛应用的凝胶电泳，是分离鉴定核酸的常规方法。因为它具有以下优点：1）琼脂糖凝胶中含有琼脂1.0%-1.5%，在这种凝胶中电泳，近似自由界面电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小；2）琼脂糖凝胶电泳支持物均匀，电泳区带整齐，分辨率高，重复性好；3）液相与固相界面无明显界限，电泳速度快；4）琼脂糖凝胶透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定；5）区带易染色，样品易回收。
核酸分子在高于其等电点的电泳缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动。分子大小不同的核酸分子具有各异的电泳迁移率，而在电泳后处于凝胶的不同位置。影响其电泳迁移率的因素包括电荷效应和分子筛效应。前者由分子所带的净电荷多少而定，这与电泳时电流强度、电泳缓冲液的pH值和离子强度有关；而后者主要与核酸分子大小和其构象以及所用琼脂糖凝胶的浓度有关。
用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。
琼脂糖凝胶电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液，混匀后再用。
常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×TBE溶液，用时稀释10倍，0.5×TBE溶液即能提供足够缓冲能力。
??溴化乙啶(Ethidium bromide, EB) 能插入核酸分子中形成复合物，在波长为260nm紫外光照射下EB可发出桔红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。通过比较样品与一系列标准样品的荧光强度，就可估算出待测样品的浓度，灵敏度可达1-5ng。
一般用1.0%－1.5% 琼脂糖凝胶电泳（含最终浓度为0.5微克/毫升的溴化乙啶）检测总RNA的质量。未降解的RNA样品应可见三条明显的28S，18S和5S rRNA区带，三条区带间可见Smear样染色，主要为大小不同的mRNA。而且，28S r RNA区带的亮度最大，5SrRNA区带的亮度最弱。
（三）紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度鉴定
??核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有一定的紫外吸收特性，其最大吸收峰的波长为260nm。另外，核酸分子在双链向单链形式转化过程中，紫外吸收增加，故单链DNA及RNA分子较双链DNA分子具有更高的紫外吸收能力。这些物理特性为测定核酸样品浓度提供了基础。在波长为260nm，光程为1cm，A260＝1时，相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单链DNA或RNA为40μg/mL，单链核苷酸为20μg/mL。紫外分光光度法可用于测定浓度大于0.25μg/mL的核酸浓度。
??分光光度法不但能测定核酸浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外吸收比值（A260 / A280）估计核酸的纯度。纯净的DNA样品的A260 / A280为1.8，纯净的RNA制品的A260 / A280为2.0。DNA样品中存在将导致比值升高，而比值降低表明有蛋白质或苯酚等污染。
??RNA浓度计算公式：C(μg/mL)＝40μg/mL×1/光程×A260 ×稀释倍数
四、 实验材料
??各种动物组织、植物组织和细胞培养材料
五、 实验用品
（一）仪器设备
??液氮罐、陶瓷研钵、冷冻高速离心机、恒温水浴器、恒温培养箱、高压灭菌锅、紫外线透射仪、吸头、乳胶手套、紫外分光光度计、电泳仪、水平式电泳槽、微波炉、Eppendorf微量离心管、微量加样器（pipetman）、三角烧瓶、烧杯、量筒。
（二）试剂
??总RNA提取试剂盒（TRIzol TM试剂）、0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)、75%乙醇、氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、10mg/ml EB溶液、 5×TBE电泳缓冲液（0.45 mol/L Tris、0.01 mol/L EDTANa2、0.45 mol/L硼酸，pH8.0）、溴酚蓝指示剂（0.25%溴酚蓝、50%甘油）、DNA marker。
六、实验步骤
(一) 细胞或组织中总RNA的提取
1、培养细胞总RNA的提取
弃去培养瓶中的培养液，加入适量的Trizol试剂（1mL/106个细胞）裂解细胞，冰上放置5min。吸入1.5mL离心管中，加入氯仿(0.2mL/mL Trizol)，冰上放置5 min。10 000×g离心10 min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10 min。10 000×g离心15 min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水溶解。
２、组织总RNA的提取
把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol 试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上放置5 min。吸入1.5mL离心管中，加入氯仿(0.2mL/mL Trizol)，冰上放置5 min。10 000×g离心10 min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10 min。10 000×g离心15 min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水(15-20 μL)溶解。
3、注意事项与提示
1）实验用的所有玻璃器皿和塑料制品须洗净后用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)浸泡12小时以上，然后灭菌去处DEPC，或将玻璃器皿于200℃干烤5小时以上，以去除RNase污染。
2)实验用的试剂必须用0.1% DEPC处理过的水配制，然后灭菌去处DEPC。
3）操作时应带手套，全过程应在上冰操作，以降低RNase活性，减少RNA降解。
4) 研磨组织块用于RNA提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后不能立即用于提取，则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。
（二）琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量
1、琼脂糖凝胶的制备
以稀释的电泳缓冲液（0.5×TBE溶液）为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶。将胶槽两端分别用透明胶紧密封住。将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。待溶胶冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB，摇匀，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却，撕去两端的透明胶，拨出梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面。
2、样品配制与加样
取2 μL RNA样品，用电泳缓冲液稀释RNA样品，加1/5体积的6×溴酚蓝指示剂，混均后，点样，记录样品次序与点样量。
3、电泳
打开电泳仪的电源开关。最高电压不超过5V/cm，当琼脂糖浓度低于0.5%，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。琼脂糖凝胶分离大分子核酸实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。
4、观察和拍照
在紫外透射仪下观察RNA条带，用拍照，或用凝胶成像系统输出照片。通过比较样品与一系列标准样品的荧光强度，可估算出待测样品的浓度。观测RNA区带，检测总RNA的质量。
5、注意事项与提示
1）溴化乙啶具有强烈的致癌作用，操作时应带手套，应避免污染实验高压台面。
2）溴化乙啶在紫外光源上放置时间过长，荧光将会猝灭。
3)紫外线对人体有损害，对眼睛尤甚，操作时应注意有效防护。
(三) 紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度鉴定
1、取5μL RNA样品，用DEPC处理的双蒸水稀释100倍，混匀后加入石英比色杯中。
2、使用前，打开电源，预热30分钟以上。
3、关上顶盖。将A/T旋钮打到T，调节到100.00。打开盖，调节到0.00。
4、加入500 μL DEPC处理的双蒸水于比色杯，重新调零。
5、将A/T旋钮打到A，测定RNA样品的A260。
6、将刻度调到280nm，并重新调零后，读取RNA样品的A280。
7、 计算A260/ A280。并根据A260/ A280大小判断RNA的纯度。
8、根据公式计算RNA浓度：C(μg/mL)＝40μg/mL×1/光程×A260 ×稀释倍数
七、实验时间安排
上午：配制所需的各种试剂，提取组织RNA。
下午：琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度法测定总RNA浓度、质量及纯度鉴定。
八、作业与思考
（一）实验结果： RNA的电泳检测图谱和浓度结果。
（二）思考题：比较核酸浓度测定的几种方法。
九、参考文献
1、胡维新 等.医学分子生物学[M].中南大学出版社，2002
实验十四 半定量RT-PCR检测基因的表达差异
一、实验目的
1、学习和掌握RT-PCR的原理和方法。
2、学习和掌握用半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法。
二、实验内容
1、 逆转录反应，以组织或细胞总RNA中的mRNA为模板，经逆转录合成cDNA；
2、以合成的cDNA为模板，以内对照GAPDH和目的基因的特异性引物进行标准PCR扩增；
3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测；
4、PCR产物的灰度扫描及基因表达差异的分析。
三、实验原理
（一）cDNA的合成
以组织或细胞总RNA中的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，以Oligo(dT)或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段。
所有合成cDNA的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基，这些活性包括依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值，最适盐浓度和最适温室各不相同，所以合成cDNA链时相应调整条件是非常重要。
AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。
（二）半定量PCR内对照的选择与基因表达水平的相对定量分析
基因表达调控研究及其它研究中，常需要对基因表达的水平进行定量比较，因此在RT－PCR技术的基础上又发展了定量PCR。这种方法需要选择一个合适的内对照。由于PCR是一指数扩增过程，逆转录及扩增效率的很小差异就会导致扩增产物量的较大差异，以致定量不准确。影响逆转录的因素有核苷酸序列的差异、ploy(A)尾的长度、PCR引物与poly(A)尾之间的距离等。影响PCR扩增效率的因素有模板、引物、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶以及循环次数等，这些参数较易控制，另外还有引物结合效率的问题，不同的引物具有不同的结合效率，它们可相差105倍，因此，进行定量PCR时要选用同一引物。目前，用于定量PCR的内对照有：（1）在细胞中恒定表达的看家基因mRNA，如-actin mRNA和GAPDH mRNA。该内对照的缺点是不能与待测mRNA共同使用一对引物，这样即使两者的逆转录效率相同，其在同一反应中的扩增效率也不尽相同，因此只能用于相对定量；（2）待测mRNA本身的基因组DNA。该内对照的设立只考虑到了两者能使用同一对引物进行PCR扩增，而忽视了逆转录这一过程，因此，也只能用于相对定量；（3）将待测mRNA的基因组DNA（经改造）构建于T7启动子或SP6启动子控制之下，用相应的DNA聚合酶在体外进行转录而产生出待测mRNA稍有不同的RNA分子（这样在PCR扩增后，电泳时扩增区带得以分开）。该内对照与待测mRNA分子均需逆转录成cDNA，且能共用同一对引物进行PCR扩增，因此能用于mRNA分子的绝对定量。其缺点是每检测一种不同的mRNA均需如此构建相应的内对照。
（三）标准PCR扩增
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是Kary Mullis于1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。PCR是利用DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。它包括变性、退火和延伸三个基本过程。这三个过程组成一个循环周期，上一个周期合成的产物又作为下一轮扩增的模板，如此反复循环，靶DNA的拷贝数呈指数增长。一般一个靶DNA分子经20轮循环就可使靶DNA的拷贝数达百万之巨。
（四）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
基本原理参见实验24。
四、实验材料
各种动物组织、植物组织和细胞培养材料的总RNA。
五、实验用品
（一）仪器设备
??冷冻高速离心机、恒温水浴器、恒温培养箱、高压灭菌锅、紫外线透射仪、吸头、乳胶手套、紫外分光光度计、电泳仪、水平式电泳槽、微波炉、Eppendorf微量离心管、微量加样器（pipetman）、PCR仪、三角烧瓶、烧杯、量筒。
（二）试剂
Reverse Transcription System 、0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)、75%乙醇、氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、dNTPs 、Taq DNA聚合酶 、引物、10mg/ml EB溶液、 5×TBE电泳缓冲液（0.45 mol/L Tris、0.01 mol/L EDTANa2、0.45 mol/L硼酸，pH8.0）、溴酚蓝指示剂（0.25%溴酚蓝、50%甘油）、DNA marker。
六、实验步骤
（一）cDNA的合成
逆转录反应，20μL反应体系中包含下物质：
MgCl2 (25mmol/L) 4μL；
10×Buffer 2μL；
dNTPs(10mmol/L) 2μL；
RNasin(40U/μL) 0.5μL；
AMV逆转录酶(24u/μL) 0.6μL；
Oliga(dT) 1μL；
RNA 2mg；
补足DEPC水。42℃水浴1 h，99℃ 5 min，-20℃保存。
（二）标准PCR扩增
采用GAPDH或目的基因序列特异性引物，分别以细胞或组织的cDNA为模板，进行PCR扩增。在20μL的总反应体系中包含下列物质:
10×PCR缓冲液 2μL；
Taq DNA聚合酶 0.4μL；
dNTPs(10mmol/L) 0.4μL；
20μmol/L 的引物pFRW 0.2μL；
20μmol/L引物pRVS 0.2μL；
组织或细胞cDNA 0.8μL（10 ng）。
在PCR扩增仪上完成PCR扩增，扩增条件如下：95℃预变性 3min，94℃ 40s、55℃－60℃退火40 s、72℃ 50 s，28个循环，72℃ 10 min。
（三）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。具体方法参照实验24。
（四）PCR产物的灰度扫描及基因表达差异的分析
以GADPH为内对照，RT-PCR产物条带用图像分析仪(Pharmacia公司产品)进行灰度扫描，Imagemaster VDS 图像分析软件测定产物条带的积分光密度值（IA）。目的片段的相对表达强度＝目的片段（IA）/GAPDH（IA）。N(IA)＝正常组织中目的片段的相对表达强度。 T(IA)＝癌变组织中目的片段的相对表达强度。
通过正常组织与癌活检组织之间RT-PCR结果的自身对照比较，以癌变组织中目的片段的相对表达强度T(IA) 与正常组织中目的片段的相对表达强度N(IA)的比值大于2或小于0.5作为差异表达的判断标准。T(IA)/N(IA)小于0.5，表明该基因在癌变组织中表达下调；T(IA)/N(IA)大于2，表明该基因在癌变组织中表达上调；T(IA)/N(IA)在0.5和2之间，表明基因在正常组织和癌变组织之间无明显表达差异。
若是进行组间统计学分析，各组测定数据（目的片段的相对表达强度）用均数±标准差（x±s）表示。用单因数方差分析（one-way ANOVA）和q检验（Student-Newman-Keuls test）对样本均数进行比较，判断基因在各组间的表达差异。
七、实验时间安排
1、第一天
上午：配制实验所需的各种试剂，准备实验所需的玻璃器皿和塑料制品；
下午：逆转录合成cDNA。
2、第二天
上午：PCR扩增和PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测；
下午：PCR产物的灰度扫描及基因表达差异的分析。
八、作业与思考
（一）实验结果：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图谱和基因表达差异的分析结果。
（二）思考题：PCR反应常遇到的问题、原因分析及解决方法。
九、参考文献
1、胡维新 等.医学分子生物学[M].中南大学出版社，2002
2、王秀奇 等.基础生物化学实验[M]. 高等教育出版社，1999
3、J.萨姆布鲁克 等 著，黄培堂等 译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.2002
4、李峰.成人视网膜假定蛋白基因ARHP的克隆和鼻咽癌相关肽基因NAP1的克隆及功能的初步研究[M].中南大学博士学位论文，2004
实验十五 基因的克隆、鉴定及生物信息学分析
一、实验目的
1、培养学生的创新意识和创新能力。在已掌握生物化学和分子生物学基础知识和基本实验技能的基础上，用科学研究的方式，获取知识、应用知识、发现问题和解决问题。
2、在任课教师的指导下，查阅资料，选题，开题，实施实验，最后以小论文的形式总结实验。
二、实验内容与基本要求
（一）查阅资料及选题
任课教师首先介绍基因克隆、鉴定及生物信息学分析资料的查阅方法，指导学生获得相关的资料，并指导学生以小组为单位从备选题目中选一实验题目或自定题目。最后由教师根据实验室具备的条件、所需时间及实验经费等情况查阅并确认学生所选题目。
（二）拟定实验提纲
学生进一步查阅与所选的实验题目相关的资料，进行必要的调查，对所选题目的现状和意义进行分析论证，提出拟研究的主要问题、重点和难点，写出实验方法、步骤及主要的预期结果，拟定出实验提纲并交教师审阅、修改和完善。
实验提纲的主要内容有：
实验题目；实验目的和意义；实验方法和步骤；所需仪器设备、材料和试剂等用品；时间安排；预期的主要结果
（三）准备实验
在教师的帮助下，根据拟定的实验提纲，以实验小组为单位进行实验的各项准备工作，包括实验用品的领取、玻璃器皿的清洗和试剂的配制等。
（四）实施实验
按照拟定的实验提纲中的实验方法步骤，各实验小组独立实施实验，做好实验记录。
（五）实验报告的写作
对实验记录进行整理、分析与总结，按照研究论文的格式写出实验报告，包括摘要、前言、材料与方法、结果、讨论和参考文献等内容。
三、参考实验项目
1、酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
2、紫外分光光度法测核酸的含量
3、DNA的琼脂糖凝胶电泳
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳
5、基因DNA的提取、扩增与检测
6、质粒DNA的提取、酶切及鉴定
7、大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化
8、RNA的提取及鉴定
9、半定量RT-PCR检测基因的表达差异
四、作业
以实验小组为单位，以研究论文格式书写实验报告交任课教师批阅。
五、参考文献
1、朱玉贤 等.现代分子生物学[M].高等教育出版社，2002
2、张成岗 等.生物信息学方法与实践 [M]. 科学出版社，2002
4、相关软件：
http://cn.expasy.org/tools/scanprosite/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://ccnt.hsc.usc.edu/cpgislands/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orf finder
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/eper.cgi
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview